Klinische Anwendung der kombinierten Überwachung von cfDNA und CTC in der Behandlung von Lungenkrebs

1. Es verfügt über ein biologisches Labor und ein PCR-Labor 2. Es hat ein Projekt von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) 3 durchgeführt. Es hat erfahrene, qualifizierte und qualifizierte Techniker 1. Es hat ein Vorhersagemodell zur Bewertung der therapeutischen Wirkung von zwei Nachweismethoden von CTC und cfDNA bei Patienten mit verschiedenen Stadien von Lungenkrebs etabliert; 2 Etablieren standardisierte Testverfahren und Ergebnisinterpretationsstandards. Bewerten Sie durch den Nachweis von CTC und cfDNA den Wert der beiden Nachweismethoden, um die Behandlung von Lungenkrebs allein und gemeinsam zu überwachen: 1) Klären Sie den Zusammenhang zwischen dem Nachweis von CTC und cfDNA und der Behandlungswirkung von Lungenkrebs und erstellen Sie ein Vorhersagemodell; 2) Veröffentlichte 1-2 SCI-Papiere. Die Folgeergebnisse gelten weiterhin als vorläufige Grundlage für das Projekt. Der Nachweis zellfreier DNA-Fragmente (cfDNA) ist eine neue und sich schnell entwickelnde "Flüssigbiopsie"-Technologie der letzten Jahre. Die Studie fand heraus, dass der abnormale Anstieg der cfDNA im Plasma und Serum von Krebspatienten [1] darauf hindeutet, dass cfDNA mit Tumoren verwandt ist und zu einem Biomarker für die Beurteilung der Prognose und Überwachung der kurativen Wirkung [2] werden könnte. Bisher wurde cfDNA gefunden, um charakteristische Genveränderungen bei Darmkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Lungenkrebs und anderen Tumoren zu haben, einschließlich Punktmutation, Mikrosatellitinstabilität, DNA-Hypermethylierung, Verlust von Heterozygoten, etc. [3]. Viele Studien haben gezeigt, dass die Genveränderungen von cfDNA mit denen von primären Tumor- und zirkulierenden Tumorzellen (CTC) [4,5] übereinstimmen. Der Nachweis von CTC oder zirkulierenden Tumorzellen-DNA (ctDNA) zellfreien DNA-Fragmenten (cfDNA) ist eine neue und sich schnell entwickelnde "Flüssigbiopsie"-Technologie der letzten Jahre. Die Studie fand heraus, dass der abnormale Anstieg der cfDNA im Plasma und Serum von Krebspatienten [1] darauf hindeutet, dass cfDNA mit Tumoren verwandt ist und zu einem Biomarker für die Beurteilung der Prognose und Überwachung der kurativen Wirkung [2] werden könnte. Bisher wurde cfDNA gefunden, um charakteristische Genveränderungen bei Darmkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Lungenkrebs und anderen Tumoren zu haben, einschließlich Punktmutation, Mikrosatellitinstabilität, DNA-Hypermethylierung, Verlust von Heterozygoten, etc. [3]. Viele Studien haben gezeigt, dass die Genveränderungen von cfDNA mit denen von primären Tumor- und zirkulierenden Tumorzellen (CTC) [4,5] übereinstimmen. CTC oder zirkulierende Tumorzell-DNA (ctDNA) kann als neuer Biomarker für Tumordiagnose, Behandlung und Prognose-Bewertung verwendet werden [6], aber sein Gehalt im peripheren Blut der Patienten ist niedrig, und es ist schwierig zu extrahieren und zu identifizieren. Aufgrund seiner komplexen Operation, hohen Kosten und langen Überwachungszyklus ist seine praktische Anwendung in der klinischen Behandlung begrenzt [7]. Bisherige Daten zeigten eine starke positive Korrelation zwischen cfDNA und ctDNA Gehalt [8]. Daher können wir indirekt das Ansprechen des Tumors auf die Behandlung überwachen, indem wir das Niveau der cfDNA detektieren. Darüber hinaus durchlaufen normale Gewebe oder Zellen auch Apoptose oder Nekrose, nachdem sie der Strahlung ausgesetzt wurden, und eine große Menge cfDNA wird in kurzer Zeit freigesetzt. Die Menge der Veränderung kann auf das Risiko von Strahlenschäden hinweisen [9]. Wie man die Veränderung des cfDNA-Gehalts im Blut mit hoher Empfindlichkeit, Genauigkeit, Geschwindigkeit, Bequemlichkeit und Effizienz detektiert, ist der Schlüssel zur klinischen Anwendung dieser "flüssigen Biopsietechnologie". Unsere kooperative Forschungseinheit hat eine Reihe von Nukleinsäure-Signalverstärkungstechnologie (SuperbDNATM) entwickelt, die indirekt das Gesamtniveau der cfDNA widerspiegelt, indem sie den Inhalt der freien Alu-Sequenz im Blut detektiert. Alu-Sequenz ist eine hoch exprimierte repetitive Sequenz, die etwa 10% des Genoms ausmacht [10], und stabil im Vollblut [11]. Ihre Expression hat eine starke Korrelation mit dem Niveau der gesamten cfDNA [12]. Diese Technologieplattform hat eine Sensitivität von 91.7% und eine Spezifität von 88.6% [13,14] zur Quantifizierung von cfDNA und hat ein globales US-Patent (Patentnummer US 2012/0003625 A1) erhalten. Diese Technologieplattform zeichnet sich durch die Verwendung modifizierter verzweigter DNA (bDNA)-Moleküle und neues Sondendesign aus, um die Verstärkung chemischer Markersignale auf der Ziel-DNA-Sequenz zu verbessern, ohne dass die Zielsequenz selbst amplifiziert werden muss (wie in Abbildung 1 gezeigt). Das Arbeitsprinzip ist wie folgt: Jede Oligonukleotid-Sondengruppe enthält zwei Arten von synthetischen Sonden, nämlich Capture Extension Sonden (CEs) und Labeled Extension Sonden (LEs). Sowohl CEs als auch LEs können an die Ziel-DNA-Sequenz binden. Zunächst MagPlex ™ Mikrokugeln (magnetische Perlen) gekoppelte Fangsonde erfasst die Ziel-DNA-Sequenz durch die gemeinsame Hybridisierung zwischen CEs-Fangsonde und CEs-Ziel-DNA. Dann kann LES mit Ziel-DNA und vorverstärkter Sonde gleichzeitig kombiniert werden. Eine Vorverstärkungssonde enthält 20-Stellen, die an die Verstärkungssonde binden, und eine Verstärkungssonde enthält auch 20-Stellen, die an die beschriftete Sonde binden. Daher wird das Zielsignal schließlich um 400-mal verstärkt. Schließlich wird die biotin-markierte Sonde mit dem phycorerythrin markierten Streptavidin (SAPE) kombiniert und die Fluoreszenzintensität der magnetischen Perlen mit Luminex-Instrument wie MAGPIX gemessen. Die Fluoreszenzintensität ist proportional zur Anzahl der in der Probe vorhandenen DNA-Moleküle, und der Grad der cfDNA in der Probe kann berechnet werden. Diese Methode realisiert den hochsensiblen quantitativen Nachweis der cfDNA-Konzentration in Plasmaproben, mit den Vorteilen keiner Extraktion, keiner Verstärkung, einfacher Bedienung, kurzer Nachweiszyklus und geeignet für den klinischen Nachweis. Im Vergleich dazu fanden Canales und andere Wissenschaftler heraus, dass SuperbDNATM einige Vorteile gegenüber PCR beim Nachweis allgemeiner 244-Gene zeigte, wie kleinere Abweichungen; Beseitigung des Einflusses von Fehlern, die durch Verlust und Verstärkung der DNA-Extraktion verursacht werden; Kreuzkontamination von Proben vermeiden; Es ist einfach, Automatisierung und Chargenerkennung zu realisieren [15]. Diese Technologie bietet uns die notwendige technische Unterstützung, um die Veränderungen der cfDNA während der Tumorbehandlung zu überwachen.