Klinische Anwendung der kombinierten Überwachung von cfDNA und CTC in der Behandlung von Lungenkrebs

1. Wir verfügen über ein Biologielabor und ein PCR-Labor. 2. Wir haben ein Projekt über zirkulierende Tumorzellen (CTC) durchgeführt. 3. Wir verfügen über erfahrenes, kompetentes und qualifiziertes technisches Personal. 1. Wir etablieren ein Vorhersagemodell zur Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit verschiedener Stadien von Lungenkrebspatienten mit CTC- und cfDNA-Testmethoden. 2. Wir etablieren standardisierte Testverfahren und Standards zur Ergebnisinterpretation. Bewerten Sie den Wert der Überwachung der Lungenkrebsbehandlung mit CTC- und cfDNA-Detektionsmethoden einzeln und in Kombination. 1) Klären Sie den Zusammenhang zwischen CTC- und cfDNA-Detektion und der Wirksamkeit der Lungenkrebsbehandlung und etablieren Sie Vorhersagemodelle. 2) Veröffentlichen Sie 1-2 SCI-Papers. Die nachfolgenden Leistungen dienen als vorläufige Grundlage für die weitere Bewerbung für das Projekt. Der Nachweis zellulärer freier DNA-Fragmente (cfDNA) ist eine aufstrebende und sich schnell entwickelnde "flüssige Biopsie"-Technik in den letzten Jahren. Forschung hat ergeben, dass es einen abnormalen Anstieg der cfDNA im Plasma und Serum von Krebspatienten [1] gibt, was auf eine Korrelation zwischen cfDNA und Tumoren hindeutet und möglicherweise zu einem Biomarker für die Beurteilung der Prognose und Überwachung der Wirksamkeit [2] wird. Bisher wurden charakteristische genetische Veränderungen in cfDNA in verschiedenen Tumoren wie Darmkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs und Lungenkrebs gefunden, einschließlich Punktmutationen, Mikrosatellitinstabilität, DNA-Hypermethylierung und Verlust der Heterozygosität [3]. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die genetischen Veränderungen in cfDNA mit denen in Primärtumoren und zirkulierenden Tumorzellen (CTC) [4,5] konsistent sind. Der Nachweis von CTCs oder zirkulierenden Tumorzellen-DNA (ctDNA) und zellfreien DNA-Fragmenten (cfDNA) ist eine aufstrebende und sich schnell entwickelnde "Flüssigbiopsie"-Technik in den letzten Jahren. Forschung hat ergeben, dass es einen abnormalen Anstieg der cfDNA im Plasma und Serum von Krebspatienten [1] gibt, was auf eine Korrelation zwischen cfDNA und Tumoren hindeutet und möglicherweise zu einem Biomarker für die Beurteilung der Prognose und Überwachung der Wirksamkeit [2] wird. Bisher wurde cfDNA gefunden, um charakteristische Genveränderungen bei Darmkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Lungenkrebs und anderen Tumoren zu haben, einschließlich Punktmutation, Mikrosatellitinstabilität, DNA-Hypermethylierung, Verlust von Heterozygosität, etc. [3]. Mehrere Studien haben gezeigt, dass die genetischen Veränderungen in cfDNA mit denen in Primärtumoren und zirkulierenden Tumorzellen (CTC) [4,5] konsistent sind. CTC oder zirkulierende Tumorzell-DNA (ctDNA) kann als neuer Biomarker für Tumordiagnose, Behandlung und Prognose-Bewertung verwendet werden [6], aber sein Gehalt im peripheren Blut der Patienten ist niedrig, was es schwierig macht, zu extrahieren und zu identifizieren. Aufgrund seiner komplexen Operation, hohen Kosten und langen Überwachungszyklus ist seine praktische Anwendung in der klinischen Praxis begrenzt [7]. Bisherige Daten deuten auf eine starke positive Korrelation zwischen cfDNA und ctDNA-Gehalt hin [8]. Daher können wir indirekt die Reaktion des Tumors auf die Behandlung überwachen, indem wir den Grad der cfDNA ermitteln. Darüber hinaus können normale Gewebe oder Zellen auch Apoptose oder Nekrose nach Exposition gegenüber Strahlung erleiden, wodurch eine große Menge cfDNA in kurzer Zeit freigesetzt wird, und die Menge der Veränderung kann auf das Risiko von Strahlenschäden hinweisen [9]. Wie Veränderungen des cfDNA-Gehalts im Blut mit hoher Empfindlichkeit, Genauigkeit, Geschwindigkeit, Komfort und Effizienz erkannt werden können, ist der Schlüssel zur Entwicklung dieser "flüssigen Biopsietechnologie" für klinische Anwendungen. Unsere Forschungsgemeinschaft hat eine Nukleinsäure-Signalverstärkungstechnologie (SuperbDNATM) entwickelt, die indirekt das Gesamtniveau der cfDNA widerspiegelt, indem der freie Alu-Sequenzgehalt im Blut erkannt wird. Die Alu-Sequenz ist eine hoch exprimierte repetitive Sequenz, die etwa 10% des Genoms ausmacht [10] und im Vollblut stabil ist [11]. Ihre Expression ist stark korreliert mit dem Niveau der gesamten cfDNA [12]. Diese Technologieplattform hat eine Sensitivität von 91,7% und Spezifität von 88,6% zur Quantifizierung von cfDNA [13,14] und hat ein globales Patent von den Vereinigten Staaten (Patentnummer US2012/0003625A1) erhalten. Das Merkmal dieser Technologieplattform ist die Verwendung modifizierter BranchedDNA (bDNA)-Moleküle und neuer Sonden-Design, um die Verstärkung markierter chemischer Signale auf der Ziel-DNA-Sequenz zu verbessern, ohne die Zielsequenz selbst zu verstärken (wie in Abbildung 1 gezeigt). Das Arbeitsprinzip ist wie folgt: Jede Oligonukleotid-Sondengruppe enthält zwei Arten von synthetischen Sonden, nämlich Capture Extension Sonden (CEs) und Labeled Extension Sonden (LEs). Sowohl CEs als auch LEs können an Ziel-DNA-Sequenzen binden. Erstens MagPlex ™ Mikrokugeln (magnetische Perlen) gekoppelte Fangsonden erfassen Ziel-DNA-Sequenzen durch Co-Hybridisierung zwischen CEs-Fangsonden und CEs-Ziel-DNA. Dann können LEs sowohl an Ziel-DNA als auch an vorkamplifizierte Sonden gleichzeitig binden. Eine Vorverstärkungssonde enthält 20-Stellen, die an die Verstärkungssonde binden, und eine Verstärkungssonde enthält auch 20-Stellen, die an die beschriftete Sonde binden. Daher wurde das Zielsignal letztendlich 400-mal verstärkt. Schließlich bindet die biotin markierte Sonde an das Streptavidin (SAPE), das mit Phycorerythrin markiert ist, und die Fluoreszenzintensität der magnetischen Perlen wird mit Luminex-Instrumenten wie MAGPIX gemessen. Die Fluoreszenzintensität ist direkt proportional zur Anzahl der in der Probe vorhandenen DNA-Moleküle, und das Niveau der cfDNA in der Probe kann berechnet werden. Diese Methode erreicht einen hochsensiblen quantitativen Nachweis der cfDNA-Konzentration in Plasmaproben mit den Vorteilen, dass keine Extraktion, keine Amplifikation, einfache Bedienung, kurzer Nachweiszyklus und Eignung für klinische Testanforderungen erforderlich sind. Canales und andere Wissenschaftler fanden durch Vergleich heraus, dass SuperbDNATM bestimmte Vorteile gegenüber PCR beim Nachweis allgemeiner 244-Gene hat, wie kleinere Abweichungen, Beseitigung der Auswirkungen von DNA-Extraktionsverlust und Amplifikationsfehlern, Vermeidung von Kreuzkontamination von Proben und Erleichterung der Automatisierung und Batch-Erkennung [15]. Diese Technologie bietet die notwendige technische Unterstützung zur Überwachung von cfDNA-Veränderungen während der Tumorbehandlung.